1.生物安全柜的选择
主要根据下列所需保护的类型来选择适当的生物安全柜：实验对象保护；操作危险度1～4级微生物时的个体防护；暴露于放射性核素和挥发性有毒化学品时的个体防护；或上述各种防护的不同组合。表1列出了每一种防护类型所推荐使用的生物安全柜。
操作挥发性或有毒化学品时，不应该使用将空气重新循环排入房间的生物安全柜，即不与建筑物排风系统相连接的Ⅰ级生物安全柜，或Ⅱ级A1型及Ⅱ级A2型生物安全柜。Ⅱ级B1型安全柜可用于操作少量挥发性化学品和放射性核素。Ⅱ级B2型安全柜也称为全排放型安全柜，在需要操作大量放射性核素和挥发性化学品时，必须使用这一类型的安全柜。
2.操作者
生物安全柜如果使用不当，其防护作用就可能大大受到影响。操作者在移动双臂进出安全柜时，需要小心维持前面开口处气流的完整性，双臂应该垂直地缓慢进出前面的开口。手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约一分钟，以使安全柜调整完毕并且让里面的空气“扫过”手和双臂的表面以后，才可以开始对物品进行处理。要在开始实验之前将所有必需的物品置于安全柜内，以尽可能减少双臂进出前面开口的次数。
3.物品放置
Ⅱ级生物安全柜前面的进气格栅不能被纸、仪器设备或其他物品阻挡。放入安全柜内的物品应采用70%酒精来清除表面污染。可以在消毒剂浸湿的毛巾上进行实验，以吸收可能溅出的液滴。所有物品应尽可能地放在工作台后部靠近工作台后缘的位置，并使其在操作中不会阻挡后部格栅。可产生气溶胶的设备（例如混匀器、离心机等）应靠近安全柜的后部放置。像有生物危害性的废弃物袋、盛放废弃吸管的盘子以及吸滤瓶等体积较大的物品，应该放在安全柜内的某一侧。在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。
耐高压灭菌的生物危害性废弃物袋以及吸管盛放盘不应放在安全柜的外面，否则在使用这些物品时双臂就必须频繁进出安全柜，这样会干扰安全柜空气屏障的完整性，从而影响对人员和物品的防护。
安全柜内的空气可以通过HEPA过滤器按下列方式排出：（a）排到实验室中，然后再通过实验室排风系统排到建筑物外面；（b）通过建筑物的排风系统排到建筑物外面；（c）直接排到建筑物外面。HEPA过滤器可以装在生物安全柜的压力排风系统（the exhaust plenum）里，也可以装在建筑物的排风系统里。有些Ⅰ级生物安全柜装有一体式排风扇，而其他的则是借助建筑物排风系统的排风扇。
Ⅰ级生物安全柜是早得到认可的，并且由于其设计简单，目前仍在世界各地广泛使用。Ⅰ级生物安全柜能够为人员和环境提供保护，也可用于操作放射性核素和挥发性有毒化学品。但因未灭菌的房间空气通过生物安全柜正面的开口处直接吹到工作台面上，因此Ⅰ级生物安全柜对操作对象不能提供切实可靠的保护。
4.实验室中生物安全柜的使用位置
空气通过前面开口进入生物安全柜的速度大约为0．45 m/s。这样速度的定向气流是极易受到干扰的，包括人员走近生物安全柜所形成的气流、打开窗户、送风系统调整以及开关门等都可能造成影响。因此，为理想的是，生物安全柜应位于远离人员活动、物品流动以及可能会扰乱气流的地方。在安全柜的后方以及每一个侧面要尽可能留有30 cm的空间，以利于对安全柜的维护。在安全柜的上面应留有30～35 cm的空间，以便准确测量空气通过排风过滤器的速度，并便于排风过滤器的更换。Ⅱ级生物安全柜在应用细胞和组织培养物来进行病毒繁殖或其他培养时，未经灭菌的房间空气通过工作台面是不符合要求的。Ⅱ级生物安全柜在设计上不但能提供个体防护，而且能保护工作台面的物品不受房间空气的污染。Ⅱ级生物安全柜有四种不同的类型（分别为A1、A2、B1和B2型），它们不同于Ⅰ级生物安全柜之处为，只让经HEPA过滤的（无菌的）空气流过工作台面。Ⅱ级生物安全柜可用于操作危险度2级和3级的感染性物质。在使用正压防护服的条件下，Ⅱ级生物安全柜也可用于操作危险度4级的感染性物质。